在肽组学分析中，质谱技术通常用于识别样本中天然存在的内源性肽段。然而，仅靠“是否存在”远远不足以揭示疾病机制或发现生物标志物。定量分析，尤其是多样本之间的差异表达比较，是理解病理变化、寻找潜在靶点的关键。iTRAQ标签技术（Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification），不仅广泛应用于蛋白组学，在特定肽组学研究中也正发挥重要作用。

一、什么是iTRAQ标签技术？原理与优势简析

iTRAQ是一种基于等重同位素标记的多通道相对定量技术，通过将不同样本的肽段打上“质量相同但碎裂后可区分”的标签，使得多个样本可在同一次质谱分析中并行比对、定量分析。

1、iTRAQ技术核心特点：

（1）多重标签：支持4-plex、8-plex，最多可实现8组样本并行分析

（2）等质量标记：标签本身不影响色谱分离或MS1质量数峰

（3）MS/MS级定量：在二级质谱中释放出各标签特有的报告离子，用于相对定量

百泰派克生物科技常用的iTRAQ 8-plex平台，适用于比较多个样本组（如疾病亚型、干预前后、生理状态差异）下的肽段表达谱，为高通量筛选提供高效工具。

二、实验流程详解：iTRAQ标签技术在肽组学分析中的标准操作路径

1、样本收集与总蛋白/肽段提取

根据研究目标和样本类型（组织、血清、尿液、脑脊液等），选择不同的肽段提取策略：

（1）样本来源

• 细胞/组织：使用冷PBS清洗，避免蛋白降解
• 体液样本：加入蛋白酶抑制剂，尽快离心除去细胞碎片

（2）肽段提取方法

• 内源肽组学研究：采用分子量截留（<10 kDa）、固相萃取或C18磁珠富集
• 可控酶解策略（如酶解短肽组）：适用于结合蛋白表达调控与功能片段研究

所有操作均在低温/保护环境下进行，以最大限度保持肽段结构与修饰状态。

2、iTRAQ标签标记

（1）标签原理

每种iTRAQ标签包含三个部分：

• 报告基团（Reporter group）：在MS/MS中释放出可识别的离子（如114、115、116等）
• 平衡基团（Balance group）：调节标签质量，总质量相同
• 反应基团（Reactive group）：与肽段N-末端和赖氨酸侧链共价结合

（2）标记流程

• 定量上样：每个样本严格定量至相同肽段总量（建议100 µg以上）
• 干燥重悬：用iTRAQ专用缓冲液重悬，避免使用含氨缓冲液（如Tris）
• 标签反应：加入各自的iTRAQ试剂，在37℃反应1-2小时
• 反应终止：加入去反应液抑制残余iTRAQ活性
• 样本混合：所有标签组分按照1:1比例混合，混合后统一进入后续处理

若富集前进行标记操作，则需确保肽段N末端未被封闭或修饰，保证标签结合效率。

3、清洗、分级与样品处理

为了降低样本复杂度、提高质谱灵敏度，通常在质谱分析前进行如下步骤：

（1）清洗步骤

• C18 SPE固相萃取柱：去除盐离子、标签副产物等干扰物
• 磁珠富集（可选）：进一步集中目标分子量段的肽段

（2）分级策略（推荐）

• 使用高pH反相液相色谱（High-pH RPLC）对混合样本进行预分离
• 将混合样本拆分为多个组分（如8~12组），降低复杂度，提高肽段识别数量

4、LC-MS/MS质谱分析

（1）分析平台

• 纳升级液相色谱系统（nanoLC）+ 高分辨质谱平台（如Orbitrap Exploris 480）
• MS/MS模式采用 HCD碎裂，可准确释放iTRAQ报告离子

（2）采集策略

• 常用DDA模式进行肽段鉴定与定量
• 可扩展至DIA、PRM模式以增强重复性与靶向验证能力

5、数据解析与定量分析

百泰派克使用专业软件与自建数据库，进行以下关键分析步骤：

（1）肽段鉴定

使用如Proteome Discoverer、MaxQuant、PEAKS等软件比对MS/MS谱图

支持UniProt、RefSeq、Ensembl等数据库对接

（2）标签离子强度提取

提取每个肽段的iTRAQ报告离子峰强，计算相对丰度比值

扣除背景噪声与标签泄漏（cross-talk）影响

（3）统计分析

差异肽段筛选（Fold Change、p值、FDR）

热图、PCA、聚类、火山图可视化表达谱

（4）功能富集与通路注释

将差异肽段回溯至来源蛋白，结合GO、KEGG、Reactome通路分析

可支持后续验证标志物预测、机制解析等需求

三、iTRAQ标签技术能否用于肽组学分析？——答案是“有条件地可以”

iTRAQ主要用于蛋白组学中的酶解肽段分析，但在特定肽组学研究中，iTRAQ也可用于对内源性肽段进行定量。其适用范围主要包括以下几类研究：

1、小分子内源肽段差异表达分析

如神经肽、激素肽、免疫相关调节肽等，这些天然存在的短肽可被直接标记，比较不同处理组下的表达变化。

2、富集肽段组分的定量研究

通过分子量截留、磁珠富集等方法预处理后获取的肽段混合物，更适合iTRAQ标签标记和定量，尤其在液体活检中常见。

3、药物干预、疾病模型中肽段响应分析

例如研究药物诱导下肽段水平变化，评估肽段是否可能为药物作用靶点或下游应答产物。

四、iTRAQ标签技术在肽组学分析中的优势与局限

1、优势

（1）定量精确：不同样本数据直接来自同一次质谱扫描，避免批次误差

（2）通量高：一次实验支持多组样本，节省成本与时间

（3）可联合蛋白组数据：方便与传统iTRAQ蛋白组数据进行整合分析，构建“蛋白-肽段”调控图谱

（4）适用于液体样本：如血清、尿液、脑脊液中的内源肽段分析，适配性强

2、局限

（1）对极短肽段适用性较差：肽段过短或缺乏标记位点（如N末端氨基或赖氨酸）会影响标签接入

（2）标记效率要求高：若标记不完全会干扰定量准确性

（3）不适用于全HLA肽组学：因HLA肽段需保持原始结构，iTRAQ标记有可能改变其构象或影响亲和验证

在需要多组样本平行定量、研究内源肽段表达差异的场景中，iTRAQ标签技术依然具备重要价值。通过合理设计实验流程和优化前处理策略，iTRAQ可以成为肽组学分析中有力的“定量引擎”。百泰派克生物科技将持续完善质谱平台与标签策略，为科研人员提供可靠、高效、精准的肽组学定量解决方案，助力更深入的生物标志物发现与机制探索。

百泰派克生物科技特色项目

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

百泰派克生物科技七大检测平台

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

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